Světelná mikroskopie a práce s mikroskopem

Laboratorní vybavení a pomůcky

Způsoby sběru, preparace a konzervace rostlinného a živočišného materiálu

Příprava mikroskopických preparátů 

Metody barvení preparátů

Elektronová mikroskopie

Dokumentace biologických objektů


Historie mikroskopie

 


1590 – 1. použitelný mikroskop zkonstruovali Hans a Zacharias Janssenové s použitím konvexní (vypouklé), tak i konkávní (vyduté) čočky.



1609 – vylepšen Galileem Galileim, který používal mikroskop k vědeckým účelům a nazval jej Occhiolino.

1625 – C. Drebbel předvedl v Londýně m., založený na dvou spojných čočkách.



Antoni van Leeuwenhoek [le:uvnhuk] 

1632 - 1723


1676 – holandský obchodník s látkami z Delfu, vylepšil tento přístroj tak, že s ním mohl pozorovat látky, které prodával.

Zvětšení až 500x – pozoroval  různé tekutiny - prvoci, kvasinky, červené krvinky a spermie.



Leeuwenhoek hledal způsob, jak co nejlépe rozlišit kvalitu vláken u látek. Proto si pořizoval lepší a lepší lupy, ale jejich kvalita jej neuspokojovala. Napadlo jej, že by si nějakou kvalitní vyrobil sám. A protože to byl člověk zvídavý, dal se do experimentů a přišel na geniálně jednoduchý způsob, jak vyrobit miniaturní kuličky skla, které mohly být použity jako malinká čočka mikroskopu. 

Po dlouhá staletí nebylo jasné, jak vlastně Leeuwenhoek své čočky vyráběl. On sám se nenápadnými zmínkami pokoušel zvědavce přesvědčit, že toho dosáhl dlouhým, pečlivým a úmorným broušením. Jenže navzdory usilovné snaze se nikomu nepodařilo něco takového zopakovat. Leeuwenhoek si proces výroby ponechal v tajnosti a nikdy jej nikomu neprozradil. Až teprve v polovině dvacátého století se jej podařilo rekonstruovat, takže víme, jak asi Leeuwenhoek své mikroskopy vyráběl. Nezávisle na sobě došli ke stejnému výsledku jak experimentátoři v Sovětském svazu, tak v Americe. Jak to tedy bylo?

Tyčinku se sodnovápenatého skla uprostřed nahřál a natavené sklo natáhl do tenoučké nitky. Nitku přelomil a její konec vložil do plamene. Oddělila se malinkatá ovšem vysoce pravidelná kulička skla. Čím menší, tím poskytovala vyšší zvětšení. 

Kuličku následně umístil mezi dva plíšky, spojené nýty či šrouby, no a z druhé strany byl na dlouhém šroubu napíchnut pozorovaný exponát. Pozorování se muselo provádět velice blízko oka směrem ke slunci. Přístroj samotný byl velice titěrný (kolem 5 cm) a ani v nejmenším se nepodobal moderním mikroskopům. 

Prohlédl si svalová vlákna velryby, šupiny na své kůži, semena mnoha rostlin, srst mnoha zvířat, mozek mouchy, volské oko, včelí žihadlo, veš, dokonce i své vlastní sperma a mnoho a mnoho dalšího. Byl jedním z prvních, kdo pozoroval buňky a jejich stavbu, popsal svalová vlákna, lidské spermie.

Reinier de Graaf a byl korespondenčním členem Královské společnosti v Londýně. Graafovi Leeuwenhoek dovolil, aby si některý z jeho drobnohledů vyzkoušel, a Graaf byl tak ohromen, že se rozhodl pro téměř nemyslitelné. I když je Leeuwenhoek jen nevzdělanec, musí se o jeho objevech Královská společnost dozvědět! 

Van Leeuwenhoek neměl příslušné vědecké vzdělání, a tak jeho popisy mikroskopického světa jsou často neobratné a naivní.

Roku 1676 poprvé uviděl pod mikroskopem bakterie, které označil jako animalcules („zvířátka“). V roce 1703 objevil sladkovodní polypy. Své výsledky, doprovázené kvalitními kresbami mikroskopických preparátů, publikoval od roku 1673 v časopise Philosophical Transactions britské Královské společnosti.


Minimalizace optických vad



1695 – David Gregory - kombinaci několika čoček s různou hodnotou disperze  minimalizace barevné vady.

1771 – Leonhard Euler – navrhl princip achromatického objektivu a matematickou metodu jeho výpočtu.

1886 – Ernst Abbe – konstruktér fi. Karl Zeiss vysvětlil princip mikroskopového zobrazení a navrhl apochromatický objektiv korigující zbytkové barevné a sférické vady zobrazení i pro vysoké hodnoty jeho numerické apertury.


Princip optického mikroskopu

Ve třicátých letech 20. století dosáhl optický mikroskop své teoretické hranice (2000 násobným) zvětšením a rozlišením 0,2 µm.

Pozorovaný předmět je umístěn těsně před předmětové ohnisko objektivu, který vytváří jeho zvětšený obraz. Ten je pak pozorován neakomodovaným okem v rovnoběžném svazku paprsků ve výstupní pupile okuláru. 

Celkové zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru.



Numerická apertura

Ernst Abbé také zjistil, že kvalita detailů zobrazení není dána velikostí zvětšení mikroskopu, ale hodnotou numerické apertury (NA) použitého objektivu, kdy se na tvorbě obrazu předmětu podílejí i nejvíce difraktované paprsky.

                                                          NA = n* sin α

n – index lomu v předmětovém prostoru a α je polovina vrcholového úhlu světelného kužele (max. 72°).

Vzduch – max. NA = 0,95. Tuto hodnotu lze zvýšit použitím různých imersních kapalin až na hodnoty NA 1,2-1,6. Nejvyšší užitečné zvětšení je 500-1000x.


Vertikální  a invertovaný mikroskop



Světelná mikroskopie


Světelná mikroskopie je základní metodou pozorování ve všech biologických oborech předmětem jejichž studia jsou buňky, tkáně, pletiva či mikroorganismy


Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu odpovídá právě velikosti buněk a některých buněčných organel. 


Maximální rozlišovací schopnost světelného mikroskopu neboli nejmenší vzdálenost, kdy lze od sebe odlišit dva objekty, je u světelného mikroskopu 0,2 µm. 



Pozorování objektů v mikroskopu se děje na základě jejich interakce s elektromagnetickým zářením (světlem).


 Rozlišovací schopnost mikroskopu závisí na vlnové délce použitého záření. 


Pokud je vlnová délka příliš dlouhá a objekt velmi malý, nedojde k přerušení vln elektromagnetického záření a pozorovaný objekt zůstane neviditelný, nebude mikroskopem rozlišen. 


Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu závisí především na rozlišovací schopnosti objektivu, protože světelný mikroskop zobrazuje dvoustupňově. 


Nejdříve je objektivem vytvářen obraz pozorovaného předmětu v horní ohniskové rovině okuláru, z něhož v druhém kroku vytváří okulárem výsledný obraz. 


Okulár však zvětšuje a přispívá k rozlišení pouze těch podrobností, které jsou obsaženy v obraze vytvořeném objektivem. 

Podrobněji 

Rozlišovací schopnost mikroskopu můžeme zvýšit použitím objektivu s větším zvětšením. 

V závislosti na indexu lomu prostředí však dochází při přechodu z jednoho prostředí do druhého k lomu paprsků. 

U suchých objektivů je mezi objektivem a preparátem vzduch s nižším indexem lomu než sklo, proto dochází na rozhraní sklo vzduch k lomu paprsků. 

Rozlišovací schopnost objektivu je vyjádřena jeho numerickou aperturou (A). 

Numerická apertura je přímo závislá na indexu lomu prostředí a otvorovém úhlu objektivu. 

Numerická apertura suchých objektivů nemůže tedy přesáhnout 1. 

Proto se někdy využívá imerzních objektivů, u nichž je mezi objektivem a preparátem vrstva imerzního oleje, který má přibližně stejný index lomu jako sklo. 

Nedochází zde proto k lomu paprsků, následkem čeho vstupuje do objektivu větší část světla. Imerzní objektiv obvykle zvětšuje 100x a používáme jej tehdy, potřebujeme-li dosáhnou maximálního rozlišení s maximálním zvětšením. 

Dalším způsobem jak ovlivnit kvalitu pozorovaného obrazu je vhodné zaclonění. 

Clonění ovlivňuje tři vlastnosti mikroskopického obrazu určující jeho kvalitu: kontrast, hloubku ostrosti a rozlišení podrobností. 

Světelný mikroskop je z optického hlediska dvoustupňová soustava tvořená objektivem a okulárem doplněná osvětlovací soustavou. 




Okulárový mikrometr je skleněná destička, která se vkládá do okuláru. Je na ní vyryta 1 cm dlouhá úsečka rozdělená na 100 dílků po 0,1 mm. Okulárový mikrometr se vkládá do okuláru, aby bylo úsečku vidět, je nutno správně seřídit světlo (clonit).

Objektivový mikrometr je podložní sklo s přilepeným krycím sklem, přičemž na krycím skle je opět vyryta úsečka, ale tentokrát o délce 1 mm rozdělena na 100 dílků po 10 µm. Pokládá se na stoleček jako preparát.

Princip práce je takový, že si nejprve určíme kolika dílkům na objektivovém mikrometru odpovídá jeden dílek okulárového mikrometru. 

Hodnota mikrometrického koeficientu vychází v mikrometrech a je nutné ji stanovit pro každý objektiv zvlášť. Tato hodnota udává kolik mikrometrů měří jeden dílek objektivového měřítka pro dané zvětšení.

Dále musíme tuto pracně určenou hodnotu použít pro vlastní měření velikosti pozorovaných objektů. 

Objektivový mikrometr vyndáme z mikroskopu a umístíme na jeho místo na stoleček normální preparát. Okulárový mikrometr ponecháme v okuláru. Nyní si vybereme v preparátu konkrétní objekt (např. izolovanou buňku) a spočítáme kolika dílkům na okulárovém mikrometru tento objekt odpovídá. Následně tento počet díků jednoduše vynásobíme mikrometrickým koeficientem pro daný objektiv a vyjde nám velikost sledované buňky v mikrometrech. 



Nejzákladnější pravidla mikroskopování:

1. Do optické osy mikroskopu nastavit nejmenší objektiv (4x nebo 10x). 


2. Pomocí makrošroubu umístit stolek “na doraz” nahoru. 


3. Osvětlit zorné pole. 


4. Zapnout žárovku a regulátorem osvětlení upravit intenzitu na přibližně na 1/2 výkonu. 


5. Zkontrolovat čistotu optiky. 


6. Na stolek položit preparát. Vyhledat a zaostřit obraz objektu. 


7. Upravit rozestup okulárů. 


8. Ověřit, zda vidíme oběma očima (okuláry) stejně dobře, případně vyrovnat dioptrickou vadu oka dioptrickým kroužkem v levém okuláru. 


9. Pohybovat preparátem a vyhledat nejvhodnější místo pro pozorování. Toto místo umístit do středu zorného pole - vycentrovat objekt. 


10. Pro vlastní pozorování vyměnit podle potřeby objektiv za jiný, a to posunem nosiče objektivů, nepohybovat stolkem mikroskopu nahoru nebo dolů došlo by k rozostření. 


11. U mikroskopování nestát, ale sedět.