1. Metody v histologii

Zobrazení živých buněk

Jednobuněčné organismy

Mnohobuněčné organismy: gamety, krvinky, buňky z tkáňových kultur

Pozorování buď speciálním mikroskopem (fázový kontrast) nebo po barvení supravitálními barvivy.


Odběr

Odběr tkání a buněk:

Ze živého organismu (BIOPSIE)

Z mrtvoly (NEKROPSIE)

Je nutno provést fixaci, jinak se tkáň vlivem vlastních enzymů a působením bakterií rozloží (AUTOLÝZA)

Blok tkáně pro fixaci  ve světelné mikroskopii nemá být větší než 1cm3


Fixace

Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů.

Fyzikální metody:         

Teplo (mikrovlnná trouba)

Zmražení  (tekutý dusík – 170 oC)

Chemické metody:

Imerzní (ponoření do fixační tekutiny)

Perfuzní (nástřik cév)


Chemická fixace

Aldehydy

Formaldehyd, glutaraldehyd

Alkoholy

Methanol, ethanol

Kyseliny

Kyselina octová, trichloroctová, pikrová

Soli těžkých kovů

Chlorid rtuťnatý, oxid osmičelý, dvojchroman draselný

Fixační tekutiny

Formaldehyd 4%

Nejčastěji používaná fixační tekutina. Reaguje zejména s bílkovinami a lipidy, nikoliv však s polysacharidy

Bouinova tekutina

trinitrofenol, formol, kys.octová

Susa

chlorid rtuťnatý, chlorid sodný, kys.octová, kys.trichloroctová, formol

Zenkerova tekutina

Chlorid rtuťnatý, dvojchroman draselný, síran sodný, kys. octová

Carnoy

ethanol, chloroform, kys.octová

Methacarn

Methanol, chloroform, kys.octová
Zalévání a krájení

Pro krájení je nutno tkáň zpevnit zalitím do zalévacích médií (parafin, celloidin).

Protože tato media nejsou mísitelná s vodou, je nutno vodu z tkání odstranit vzestupnou řadou alkoholů (odvodnění) a poté prosytit rozpouštědlem zalévacího media (xylen, toluen, aceton), který tkáň „projasní“.


Zalévání

V malém množství se tkáň prosycuje parafinem v kádinkách v termostatu.

Pro provoz na patologii slouží přístroje na  automatické zalévání.


Krájení

Tkáň je třeba nakrájet na řezy o tloušťce jedné vrstvy buněk, tedy 4-10 μm. Tkáň je pak průhledná a „dobře čitelná“

Přístroje, které se k tomu užívají se jmenují mikrotomy.

Nakrájené řezy se dávají na podložní sklo, kde se teplem natáhnou. K přilepení se používá bílek-glycerin



Odkaz:

https://www.youtube.com/watch?v=ml4fBEmH8Sg


Barvení

Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání. 

Barviva jsou rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezu odstranit parafin.

Po obarvení se řez montuje do pryskyřic. Tak vzniká trvalý preparát, který se prohlíží v mikroskopu.

Z řezů je třeba odstranit parafin a znovu je zavodnit, aby bylo možno tkáně barvit.

Většina barviv je rozpustných ve vodě.



Trvalý preparát

Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda

Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí kanadského

    balzámu ( má stejný lom

    světla jako sklo) nebo

    umělých pryskyřic

Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT


Postup


Video:

https://www.youtube.com/watch?v=z-WoPn2YLRQ


Barvení

Přehledná

Hematoxylin eosin

Massonovy trichromy

Weigert van Gieson

Heidenhainův železitý hematoxylin


Selektivní

Weigert resorcin fuchsin

Impregnace stříbrem


Hematoxylin - eosin

Hematoxylin barví kyselé součásti buňky (bazofilní struktury) –  DNA, RNA, tj. jádro, jadérko, ribozomy a granulární endoplasmatické retikulum.

Eosin barví zásadité struktury buňky  (acidofilní, eosinofilní) – což jsou hlavně proteiny, tj. cytoplasmu, mitochondrie, hladké endoplasmatické retikulum,a kolagen v mezibuněčné hmotě.


Video:

https://www.youtube.com/watch?v=2D0rj0m6dVs



¨

AZAN

Azokarmín barví jadra červeně

Anilínová modř barví kolagenní vlákna a mucin modře

Oranž G barví cytoplasmu buněk a svaly oranžově

Erytrocyty jsou červené





Weigert – van Gieson

Weigertův hematoxylin barví jádra šedě.

Saturnová červeň (nebo kyselý fuchsin) barví kolagenní vlákna červeně.

Kyselina pikrová barví cytoplasmu buněk a svalovinu žlutě.








Weigert resorcin - fuchsin

Resorcin fuchsin barví elastická vlákna fialově

Selektivní barvení na elastiku