Řezové preparáty

Etapy

Odběr tkáně

Fixace

Vypírání fixáže

Zalití do krájecího média

Řezání

Odběr tkáně a fixace

Zvíře narkotizujeme, usmrtíme a odkrvíme.

Vyjmeme požadovanou tkáň:

0,5 cm

Fixace:

Rychlé usmrcení buněk a denaturace proteinů s min. změnami.

Vyschnutím (pouze krevní roztěry)

Zmražením (tekutý N2) nebo mrazící box

Chemická

Chemická fixace:

OsO4 – cytoplazma a lipidy, malá pronikavost.

CrO3 – maceruje, nejvíce ve směsi s K2Cr2O7, malá pronikavost.

HgCl2 (sublimát) – jed, barvitelnost tkání, fixace jádra.

K2Cr2O7  – pouze ve směsích, protože fixuje špatně

Kys. octová ledová (CH3COOH) – pouze ve směsích, rychle proniká, ale narušuje mitochondrie.

Kys. trichloroctová – rychle proniká a nenarušuje mitochondrie, dekalcifikace kostí – řezové preparáty.

Kys. pikrová – rychle sráží bílkoviny, dobrá barvitelnost a žluté zbarvení tkání.

Alkoholy a formaldehyd

Ethanol – směsi, drobné struktury smršťují, snížená barvitelnost.

Methanol – jed, pouze krevní nátěry.

Formaldehyd (formol – 35-40 % roz.) – nejpoužívanější 6-10 % roz. – sráží bílkoviny, nerozpouští tuky, zachovává mitochondrie.

Vypírání fixáže – alkoholem nebo vodou.

Zalévání do parafínu

Prosycení tkáně horkým parafínem – ochlazení a zatuhnutí  řezání.

Smrštění tkáně.

Nevhodné pro kosti, zuby a šlachy.

Fáze zalévání:

Odvodnění objektu

Prosycení rozpouštědlem  parafínu

Prosycení parafínem

Vlastní zalití.

Odvodnění objektu

Vzestupná alkoholová řada: několik hod.

Začínáme 70%  (zřídka 50 a 60%)

80%

96%

Absolutní ethanol.

Prosycení rozpouštědlem parafinu

Xylen (větší ztvrdnutí a lámavost tkáně)

Benzen (2-3 lázně benzenu – 10-15 min.).

Prosycení parafínem

Parafín + rozpouštědlo (35 -40°C) – po rozpuštění parafínu vložíme objekt na 30 min.

Čistý parafín – postupně ve 3 lázních (> 50, ale < 58°C = 2 a více hod.).

Vlastní zalití:

Příprava komůrky z hladkého papíru

Do ní nakapeme rozehřátý parafín

Vložíme objekt

Ztuhnutí parafínu ve studené vodě

Odstranění papírové komůrky a krájení.

Chyby při zalévání

Bělavý a drobivý bloček = nekvalitní parafín.

Měkký a bělavý b. = v parafínu zůstal benzen.

B. s dutinou s měkkým, bílým parafínem = pomalé chladnutí parafínu.

Popraskaný b. = příliš studená voda.

Voda v b. = parafín nebyl ztuhlý při úplném ponoření do vody.

Prohlubeň ve středu b. = moc vysoká komůrka.

Tkáň nedrží v bločku = špatné odvodnění.

T. je tvrdá = zbytky médií v objektu

T. se smrštila a špatně se barví = vysoká teplota při prosycování a zalévání.

Příprava parafínového bločku

B. připevníme na dřevěný špalík nahřátou lopatičkou nebo skalpelem na protější straně od řezaného objektu.

B. připevníme do mikrotomu a vrchní stranu zarovnáme nožem mikrotomu.

Nůž musí mít 10-15° sklon směrem k vodorovné hraně bločku.

Krájení řezů

Lepení řezů

Čisté podložní sklo s kapkou dáme kapku glycerinbílku (glycerin + bílek – 1:1).

Rozetřeme a přidáme vodu pomocí štetce, na kterou rozprostřeme řezy.

Dáme na vyhřívanou ploténku (40-45 °C), kde se řezy natáhnou.

Schnutí – 12 hod.

Chyby při krájení

Řezy se svinují do ruličky = tvrdý parafín nebo silné řezy.

Ř. zůstávají na noži = měkký parafín nebo vysoká teplota při krájení.

Ř. se mažou = špatně zalitý objekt nebo benzen  zůstal v bločku.

Ř. se drobí = krystalizovaný parafín.

Ř. zůstávají na bločku = tupý nůž.

Příčné čáry a rýhy na ř. = porušené ostří nože.

Ř. netvoří pásku = špatně seřízlý bloček.

Objekt vypadává z řezu = špatně prosycený parafínem.

Nestejně silné řezy = malý sklon nože.

Barvení řezů

Hematoxylinová barviva – jádra, mitochondrie.

Eosin – cytoplazma.

Nejprve řez zbavíme parafínu v xylenu - absolutní alkohol - sestupná alkoholová řada - dH2O (5 min.).

Barvení – speciální nádoby (kyvety)

Podložní skla přendaváme pinzetou

Necháváme okapat, ale nesmí oschnout

Barvení hematoxylinem a eosinem

Hematoxylin – 3 až 10 min.

Voda – krátce.

Praní v tekoucí vodě do zmodrání řezů – mikroskop.

Okyselený alkohol – diferenciace – mikroskop.

Voda – krátce.

Eosin – 3 až 5 min.

Odvodnění a montáž

80 % alkohol – 1 až 3 min.

96 % alkohol – 1 až 3 min.

100 % alkohol – 5 min.

Xylen I – 5 min.

Xylen II – 5 min.

Zamontování do kanadského balzámu – na řez dáme kapku k. b. a přiložíme krycí sklíčko