Barvení mikroskopických preparátů 2

Kyselá - barvící plasmu (též plasmatická) - eosin, světlá zeleň, oranž G, 

              kyselý fuchsin,…

 Zásaditá, basická - barvící jádro (též jaderná barviva) - toluidinová modř,

metylová zeleň, basický fuchsin, 

hematoxylin

 Neutrální - např. eosinát methylenové modři.

TYPY BARVENÍ:

A1/ progresivní - barvíme až je dosaženo žádaného zbarvení,

A2/ regresivní - napřed tkáň přebarvíme, pak přebytečné barvivo odstraňujeme.

B1/ sukcedánní - několik barviv po sobě,

B2/ simultánní - více barviv současně.

- v obou případech musí každé barvivo barvit jinou část tkáně

(C1/ substantivní - tkáň barvíme přímo barvivem)

(C2/ adjektivní - barvení prostřednictvím mořidla, které se váže přímo na tkáň)

Vitální barvení je způsob, kdy je tkáň barvena za živa. Rozeznáváme barvení

intravitální, kdy barvíme přímo v těle zvířete a barvení supravitální, kdy barvíme z těla vyňatou tkáň.

Příklady:

1/ Pozorování a barvení živých prvoků z nálevu

Postup:

 na podložní sklo dejte kapku nálevu a přikryjte (pro zvolnění rychlosti pohybu prvoků poslouží vata)

 vedle krycího sklíčka kápněte: 

kapku inkoustu - je vidět cytostom (buněčná ústa) a trichocysty (váčky s toxinem umístěné pod pelikulou rovnoměrně  - slouží jako obrana a k lovu – explozivní cysty – při podráždění vystřelí rosol a ten ztuhne a vytvoří bodec)

kapku tuše - je vidět plnící se potravní vakuola.

2/ Barvení nálevníků po usmrcení

 na podložní sklo dejte po kapce nálevu, usmrťte kapkou Lugolova roztoku (3-6 minut), přikryjte krycím sklíčkem

 vedle krycího sklíčka z jedné strany kápněte kapku modrého inkoustu, obarví se jádro (makronukleus)

 z druhé strany přikápněte kapku červeného inkoustu, obarví se cytoplazma.

Giemsa

Giemsův roztok se používá buď koncentrovaný, nebo ředěný destilovanou vodou. Fixovaný preparát se namáčí standardně na 30 minut, v naléhavých případech je možné zvýšit koncentraci a dobu barvení zkrátit. 

Baktérie se barví modře, pouzdra světle modře, sliz růžově. 

Gramovo barvení

Zkoumaný vzorek nebo kulturu bakterií naneseme na podložní sklo a postupně nanášíme barvící roztoky. Každý roztok necháme působit cca 1 minutu. Postup si snadno zapamatujeme podle zkratky VLAS (VLAK)

Gramovo barvení

krystalová Violeť

Lugolův roztok

Alkohol

opláchnutí vodou

Safranin nebo Karbolfuchsin

Grampozitivní bakterie mají stěnu tvořenou peptidoglykanem a polysacharidy, kterými prochází kyselina teichoová. Při barvení se krystalová violeť dostává do buněk a tvoří s Luglovým roztokem modrou komplexní barvu. Alkohol není schopný prostoupit buněčnou stěnou a rozpustit komplex. Dobarvení safraninem dodá bakteriím tmavě fialovou barvu.

G+ koky: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus;

G+ bacily: Corynebacterium, Clostridium, Listeria, Bacillus.

Gramnegativní bakterie mají stěnu tvořenou tenkou vrstvou peptidoglykanu a vrstvou lipopolysacharidu. Při stejném postupu dochází ve třetím kroku k vyplavení komplexu alkoholem a k odbarvení. Safranin dobarví bakterie červeně.

G– koky: Neisseria;

G– kokobacily: Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Legionella, Brucella, atd.

G– bacily: Klebsiella, E. coli, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Vibrio, Pseudomonas, Proteus, Helicobacter pylori, Yersinia, Campylobacter, Salmonella, Bacillus fragilis, atd.

G labilní a nebarvící se

Některé bakterie, zvláště po dlouhé kultivaci a několikanásobném pasážování, nebo pokud přežijí útok antibiotik proti buněčné stěně (L-formy), se mohou změnit z G+ na G–.

Bakterie, které obsahují ve své stěně hodně mastných kyselin a vosků (Mycobacterium tuberculosis), se nemusí barvit podle Grama vůbec.