Měření objektu pod mikroskopem

Měříme rozměry kolmé k optické ose:

Šířka

Délka

Ve směru optické osy:

Tloušťka objektu.

Měření objektu probíhá vzhledem k známým rozměrům – normál  srovnání normálu s pozorovaným objektem.

Měření délky objektu

Normál = okulárový mikrometr (např. 1 cm dělený na 100 dílků).

Objekt i měřítko musí být ve stejném směru.

Získáme relativní rozměry objektu.

Určení absolutní velikosti pomocí skutečného normálu = objektivní mikrometr.

Podložní sklíčko se stupnicí (většinou 1 mm dělený na 100 dílků).

Postup při měření

Měřítko objektivního mikrometru (ob), tak aby se krylo s některými dílky měřítka okulárového mikrometru (ok).

Určíme počet shodujících se dílků obou mikrometrů.

m = ob / ok

Absolutní délku objektu zjistíme m x délka objektu v okulárovém měřítku. 

Postup měření:

1. Na stolek mikroskopu vložíme místo preparátu objektivové měřítko.

2. Okulárem s měřítkem zaostříme objektivové měřítko.

3. Obě měřítka srovnáme do rovnoběžné polohy otočením okuláru a posunem objektivového měřítka na křížovém stolku tak, aby se vzájemně překrývaly.

4. Objektivní mikrometr posouváme až do okamžiku, kdy se jeho počáteční ryska kryje s počáteční ryskou OK měřítka. Hledáme pak, která další ryska OK měřítka se přesně kryje s některou ryskou OB měřítka a spočítáme, kolik dílků OK a OB stupnice se vzájemně rovná.

5. Vypočítáme mikrometrický koeficient  (k)  použitého objektivu podle vzorce:

           počet dílků OB měřítka . 10

k = ------------------------------------------------           [µm]

odpovídající počet dílků OK měřítka

Mikrometrický koeficient udává, kolika mikrometrům odpovídá jeden dílek OK měřítka pro daný objektiv.

6. Vypočítané hodnoty k  pro jednotlivé objektivy školního mikroskopu zapíšeme do tabulky.

Poznámka:

Mikrometrický koeficient platí jen pro určitý objektiv, okulár a danou délkou tubusu. Mění-li se některá z těchto složek, musí se koeficient vypočítat znovu. 

Měření tloušťky objektu

Pomocí mikrometrického šroubu – 1 dílek = 2 μm.

Při měření zaostříme postupně na horní a dolní plochu objektu – odečteme počet dílků na mikrošroubu x 2.

Počítání mikroskopických objektů

Potřeba spočítat množství buněk:  hematologie zjišťování počtů krvinek.

Buňky lze počítat v různě upravených komůrkách pod mikroskopem, nebo průtokovým cytometrem:

speciální počítače, jejichž princip je např. , že suspenze buněk (v elektrolytu) o přesném objemu je nasávána úzkým otvorem (do elektricky nevodivé trubice) mezi dvěma elektrodami a přístroj registruje průchod každé buňky jako jeden el. impuls. 

Nejrozšířenější jsou v tomto směru počítače krvinek.

Počítací Bürkerova komůrka 

Počítací Bürkerova komůrka se skládá ze speciálně upraveného podložního skla, kde jsou 4 podúrovňové drážky, 2 čtvercové sítě a z krycího sklíčka.

Počítání buněk v počítací Bürkerově komůrce

Princip komůrky je založen na rozměrech čtvercové sítě (3 x 3 mm) a vzdálenosti mezi krycím sklíčkem a právě čtvercovou sítí, která je 0,1 mm. 

Každá čtvercová síť obsahuje 9 větších čtverců o rozměrech 1 mm². 

Do komůrky s krycím sklíčkem vstříkneme kapalinu s buňkami, které chceme spočítat, pak její objem nad jedním čtvercem je 0,1 mm³. 

Každý větší čtverec obsahuje 16 menších o rozměrech 0,04 mm² (1/25) a objemu 0,004 mm³ (1/250). 

Počet buněk v 1 ml kapaliny určíme, tak že spočítáme jejich počet nad 25 menšími čtverci x 10 000 x ředění (objem zředěného roz. / objem originálního roz.).

Průtoková  cytometrie 

Měření a analýza fyzikálních -chemických vlastností buňky během průchodu laserovým paprskem.

Identifikace různých buněčných typů uvnitř smíšené populace, analýza jednotlivých subpopulací v rámci jedné populace 

Rychlá, přesná a reprodukovatelná metoda:

měření několika parametrů až na 100 000 buněk za 1 sekundu 

Komponenty průtokového cytometru

Fluidní systém 

průtoková komůrka

nosná kapalina 

hydrodynamická fokusace 

Optický systém 

Laserový paprsek 

Forward scatter (FSC) 

Side scatter (SSC) 

emitované fluorescenční signály 

Typizace jednotlivých  buněčných  populací za využití reakce antigen-protilátka. 

Reakce je vizualizována označením protilátky fluorochromem (FITC,PE,PC5). 

Počítačový systém 

Výstupem měření jsou pak výsledky v grafické a číselné formě: 

jednoparametrové histogramy 

dvouparametrové histogramy 

zastoupení buněk nesoucí daný antigen v procentech 

Využití průtokové cytometrie

Imunofenotypizace  leukemií a lymfomů 

DNA analýza 

Funkční vyšetření leukocytů 

Stanovení intracelulárního vápníku 

Diagnostika defektů imunity 

Cytometrické vyšetření solidních nádorů 

Diagnostika a monitorování autoimunních chorob 

Transplantační imunologie