1. Fluorescenční mikroskopie

Fluorescence

Fluorescence vzniká, když molekula po excitaci zářením (ve formě fotonu) o vhodné vlnové délce vyzáří nižší energii (fluorescence) při návratu do základního stavu (tzn. vyzářené světlo má delší vlnovou délku než excitační záření).

Díky tomu, že excitační a fluorescenční záření mají rozdílnou energii a tak se dají od sebe snadno odlišit a oddělit.




Fluorescenční mikroskop

Pomocí f. mikroskopů pozorujeme rozložení fluorescenčního signálu ve fluorescenčně obarvených mikroobjektech.

Dva základní typy fluorescenčních mikroskopů:

mikroskopie širokého pole, kdy ozařujeme najednou celý vzorek a snímáme fluorescenční signál z celé ozářené plochy.

skenovací konfokální mikroskopie, při které projíždíme vzorek bod po bodu s vysoce zaostřeným laserovým paprskem, měříme fluorescenční signál v každém bodě a výsledný obrázek vzniká zobrazením různé síly fluorescence pro jednotlivé body.


Transmisní fluorescenční mikroskop

U tohoto mikroskopu prochází světlo excitačním filtrem a na preparát přichází zespodu. Pro osvětlení preparátu se však používá zástinový kondenzor, který odráží světlo tak, že na preparát dopadá boční světlo a do objektivu se tak dostane uvolněná fluorescence.


Procházející excitační světlo tak letí mimo objektiv.


Epifluorescenční mikroskop

U tohoto typu mikroskopu prochází excitační světlo objektivem, dopadá na preparát svrchu a uvolněné fluorescenční záření se vrací zpět do objektivu. 

Je zřejmé, že u tohoto mikroskopu je potřeba použít zvláštní typ zrcadla, které odráží excitační světlo do objektivu a propouští emisní světlo do okuláru.


Používá se dichroické zrcadlo, které maximum excitačního světla odráží a maximum emisního světa propouští. 


Konfokální mikroskop


Konfokální mikroskop umožňuje odstranit z obrazu objektu šum, který vytváří fluorescence vyzářená z těch rovin vzorku, na které není zaostřena optika.

Zdrojem světla je zpravidla laser, světlo prochází úzkou štěrbinou a je zaostřeno do jednoho bodu vzorku. 

Fluorescence z ozářeného bodu je pak snímána detektorem. Na detektor dopadá pouze fluorescence ze zaostřených ozářených bodů. 

Signál z detektoru je odeslán do počítače, který zároveň dostává informaci o souřadnicích snímaného bodu. 

Tímto způsobem je bod po bodu prozářen celý objekt v různých optických rovinách, což je automatizováno a ovládáno řídícím počítačem. 


Vlastní fluorescence buněk

Buněčné složky viditelné ve fluorescenčním mikroskopu:

proteiny – fluorescence v ultrafialové oblasti 

redukované formy NADH (nikotinamidadenindinukleotidu), NADPH, oxidované formy flavoproteinů, vitamin A – fluorescence ve viditelné oblasti (modrá až žlutá) 

cytochromy, peroxidáza, hemoglobin, myoglobin, chlorofyl – fluorescence ve viditelné oblasti (červená) .


Proteinové fluorofory


Většina organických molekul nefluoreskuje.

Intenzivní fluorescenci vykazují některé aromatické sloučeniny (polyaromatické uhlovodíky nebo heterocykly) nazývané fluorofory nebo fluorescenční barviva.

Proteiny obsahující aromatické aminokyseliny tryptofan (Try), tyrozin (Tyr) a fenylalanin (Phe).

Jejich absorpční pás leží mezi 240 a 300 nm.


Fykobiliproteiny a fytofluory


Fykobiliproteiny - ze sinic a modro-zelených a červených řas, které absorbují od 470 do 650 nm (tj. v oblasti, kde neabsorbuje chlorofyl).

Fytofluory - fluorescenční sondy odvozené od fytochromů (proteinů citlivých na světlo, které jsou přítomny ve fotosyntetizujících organismech). 


Imunofluorescence

Imunofluorescence je technika používaná pro světelnou mikroskopii s fluorescenčním mikroskopem a používá se především na mikrobiologických vzorcích. Imunofluorescence je široce používaným příkladem imunoznačení (použití protilátek k barvení proteinů) a je konkrétním příkladem imunohistochemie (použití vztahu protilátka-antigen v tkáních).

Imunofluorescence může být použita na tkáňových řezech, kultivovaných buněčných liniích nebo jednotlivých buňkách a může být použita k analýze distribuce proteinů , glykanů a malých biologických a nebiologických molekul.

Imunofluorescence může být použita v kombinaci s jinými metodami fluorescenčního barvení bez protilátek, například s použitím DAPI ke značení DNA.

V nějakém zvířeti, (např. králík, koza, myš, atd) musí být proti izolovanému proteinu, který nás zajímá vytvořena protilátka, kterou je nutno získat a vyčistit. Pokud možno je vhodné ji sfůzovat s tumorovými buňkami a získat "nesmrtelnou" linii buněk, které produkují požadovanou protilátku.

K výrobě protilátek značených fluorochromem musí být fluorochrom konjugován („označen“) s protilátkou. Podobně může být antigen také konjugován s protilátkou pomocí fluorescenční sondy technikou nazývanou technika fluorescenčního antigenu.

Existují dvě třídy imunofluorescenčních technik, využívající primární protilátku, nebo sekundární protilátku.

1)Primární protilátka rozpoznává cílovou molekulu (antigen) a váže se na specifickou oblast zvanou epitop. Připojený fluorofor lze detekovat pomocí fluorescenční mikroskopie, která v závislosti na použitém poslu emituje po excitaci specifickou vlnovou délku světla. Přímá imunofluorescence, i když poněkud méně častá, má oproti sekundárnímu (nepřímému) postupu významné výhody. Přímé připojení posla k protilátce snižuje počet kroků v postupu, šetří čas a snižuje nespecifický signál pozadí. To také omezuje možnost zkřížené reaktivity protilátky a možných chyb v průběhu celého procesu. V této metodě však existují určité nevýhody. Protože počet fluorescenčních molekul, které se mohou vázat na primární protilátku, je omezený, přímá imunofluorescence je podstatně méně citlivá než nepřímá imunofluorescence a může vést k falešným negativům. Přímá imunofluorescence také vyžaduje použití mnohem primárnější protilátky, která je extrémně drahá a někdy dosahuje až 400,00 USD / ml.



Fluorescenční značení aktinu v hladkém svalu


Sekundární (nepřímá) imunofluorescence používá dvě protilátky; neznačená první (primární) protilátka se specificky váže na cílovou molekulu a sekundární protilátka, která nese fluorofor, rozpoznává primární protilátku a váže se na ni. Několik sekundárních protilátek se může vázat na jednu primární protilátku. To zajišťuje zesílení signálu zvýšením počtu molekul fluoroforů na antigen.Tento protokol je složitější a časově náročnější než primární (nebo přímý) protokol výše, ale umožňuje větší flexibilitu, protože pro danou primární protilátku lze použít řadu různých sekundárních protilátek a detekčních technik.

Různé primární protilátky s různými konstantními oblastmi jsou obvykle generovány vytvářením protilátky u různých druhů. Například lze vytvořit primární protilátky v koze, které rozpoznávají několik antigenů, a pak použít králičí sekundární protilátky vázané na barvivo, které rozpoznávají konstantní oblast kozí protilátky („králičí anti-kozí“ protilátky). Je možné vytvořit druhou sadu primárních protilátek u myši, kterou lze rozpoznat samostatnou sekundární protilátkou „anti-myší“. To umožňuje opětovné použití obtížně vyrobitelných protilátek vázaných na barvivo ve více experimentech.

Imunofluorescence je omezena pouze na fixní (tj. mrtvé) buňky, když mají být struktury uvnitř buňky vizualizovány, protože protilátky nepronikají buněčnou membránou při reakci s fluorescenčními značkami. Antigenní materiál musí být pevně fixován na místě jeho přirozené lokalizace uvnitř buňky. Intaktní protilátky mohou být také příliš velké na barvení rakovinných buněk in vivo . Jejich velikost vede k pomalé penetraci tumoru a dlouhému poločasu v oběhu.


Zelený fluorescenční protein ( GFP )

Zelený fluorescenční protein ( GFP ) je protein, který vykazuje jasně zeleně fluoreskuje, když je vystaven světlu v modré do ultrafialové oblasti. Označení GFP tradičně označuje protein původně izolovaný z medúzy Aequorea victoria.  V buněčné a molekulární biologii se gen GFP často používá jako reportér (značení) exprese. Používá se v modifikovaných formách k výrobě biosenzorů a byla vytvořena řada zvířat, která exprimují GFP, jedná se o koncepci, která umožňuje, že gen lze podle potřeby exprimovat v celém daném organismu, ve vybraných orgánech nebo v buňkách, které nás zajímají.

U A. victoria dochází k fluorescenci GFP, když aequorin interaguje s ionty Ca 2+ a indukuje modrou záři. Část této luminiscenční energie se přenáší do GFP, čímž se celková barva posune směrem k zelené.  Jeho užitečnost jako nástroje pro molekulární biologové se však začala realizovat až v roce 1992Douglas Prasher uvedl klonování a nukleotidovou sekvenci wtGFP v genu .Financování tohoto projektu skončilo, proto Prasher poslal vzorky cDNA do několika laboratoří. Laboratoř Martina Chalfieho exprimovala kódující sekvenci wtGFP s odstraněnými několika prvními aminokyselinami v heterologních buňkách E. coli a C. elegans a výsledky publikovala v časopise Science v roce 1994. Laboratoř Fredericka Tsuji nezávisle uvedla expresi o měsíc později.  Je pozoruhodné, že molekula GFP se složila a byla fluorescenční při pokojové teplotě, aniž by bylo potřeba exogenních kofaktorů specifických pro medúzy. Ačkoli tento téměř wtGFP byl fluorescenční, měl několik nevýhod, včetně dvojitých špičkových excitačních spekter, citlivosti na pH, citlivosti na chloridy, špatného kvantového výtěžku fluorescence, špatné fotostability a špatného skládání při 37 °C.

Rozmanitost genetických mutací ilustruje tato plážová scéna v San Diegu nakreslená živými bakteriemi exprimujícími 8 různých barev fluorescenčních proteinů (odvozených od GFP a dsRed).

Superfolder GFP ( sfGFP ), je řada mutací, které umožňují GFP rychle se skládat a zrát, i když jsou fúzovány se špatně se skládajícími peptidy, - objev v roce 2006.

Bylo provedeno mnoho dalších mutací, včetně barevných mutantů; zejména modrý fluorescenční protein (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), azurový fluorescenční protein (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) a žluté fluorescenční proteinové deriváty (YFP, Citrin, Venus, YPet). 


Byl vyvinut zelený fluorescenční proteinový mutant ( BFPms1 ), který přednostně váže Zn (II) a Cu (II)FPms1. Vazba Zn (II) zvyšuje intenzitu fluorescence, zatímco vazba Cu (II) potlačuje fluorescenci a posouvá maximum absorbance z 379 na 444 nm. Proto je lze použít jako biosenzor Zn.



Varianty GFP a DsRed



fluorescenční chromofor


Zelený fluorescenční protein lze využít jako reportérový gen 

Například GFP lze použít jako reportér úrovní toxicity pro životní prostředí. Ukázalo se, že tento protein je účinným způsobem měření úrovní toxicity různých chemikálií, včetně ethanolu, str-formaldehyd, fenol, triklosan a paraben. GFP je skvělý jako reportérový protein, protože nemá žádný účinek na hostitele, když je zaveden do buněčného prostředí hostitele. Díky této schopnosti není potřeba žádné externí vizualizační barvivo, ATP nebo kofaktory. Pokud jde o úrovně znečišťujících látek, byla měřena fluorescence, aby se změřil účinek, který mají znečišťující látky na hostitelskou buňku. Byla také měřena buněčná hustota hostitelské buňky. Výsledky studie - Song, Kim a Seo (2016) ukázaly, že když se zvyšovaly hladiny znečišťujících látek došlo ke snížení jak fluorescence, tak buněčné hustoty. To svědčí o skutečnosti, že buněčná aktivita poklesla.


Fluorescenční mikroskopie

Zatímco většina malých fluorescenčních molekul, jako je FITC (fluorescein isothiokyanát), je při použití v živých buňkách silně fototoxická , fluorescenční proteiny, jako je GFP, jsou při osvětlení v živých buňkách obvykle mnohem méně škodlivé. To vyvolalo vývoj vysoce automatizovaných systémů fluorescenční mikroskopie živých buněk, které lze použít k pozorování buněk v čase exprimujících jeden nebo více proteinů označených fluorescenčními proteiny.

Existuje mnoho technik, jak využít GFP v experimentu se zobrazováním živých buněk. Nejznámějším způsobem jak využít GFP je jeho přímé připojení k požadovanému proteinu. Například GFP může být součástí plazmidu exprimujícího jiné geny, které indikují úspěšnou transfekci požadovaného genu. Další metodou je použití GFP, který obsahuje mutaci, kde se fluorescence v průběhu času změní ze zelené na žlutou, což se označuje jako fluorescenční časovač. Pomocí fluorescenčního časovače lze studovat stav produkce proteinu, jako je nedávno aktivovaný, nepřetržitě aktivovaný nebo nedávno deaktivovaný na základě barvy vytvářené fluorescenčním proteinem.


Například GFP byl široce používán při označování spermií různých organismů pro účely identifikace jako v Drosophila melanogaster , kde může být exprese GFP použita jako marker pro konkrétní charakteristiku. GFP lze také exprimovat v různých strukturách umožňujících morfologické rozlišení. V takových případech je gen pro produkci GFP začleněn do genomu organismu v oblasti DNA, která kóduje cílové proteiny a která je řízena stejnou regulační sekvencí; to znamená, že regulační sekvence genu nyní kromě značeného proteinu (proteinů) řídí produkci GFP. V buňkách, kde je gen exprimován a jsou vytvářeny značené proteiny, je současně produkován GFP. Takže pouze ty buňky, ve kterých je exprimován značený gen, nebo jsou produkovány cílové proteiny, budou fluoreskovat, pokud jsou pozorovány fluorescenční mikroskopií. Analýza takových časosběrných filmů předefinovala chápání mnoha biologických procesů, včetně skládání proteinů, transportu proteinů a dynamiky RNA, které byly v minulosti studovány pomocí fixovaného (tj. mrtvého) materiálu. Získaná data se také používají ke kalibraci matematických modelů intracelulárních systémů a k odhadu rychlosti genové exprese. Podobně lze GFP použít jako indikátor exprese proteinu v heterologních systémech. V tomto případě jsou fúzní proteiny obsahující GFP zavedeny nepřímo, s použitím RNA konstruktu, nebo přímo se samotným označeným proteinem. Tato metoda je užitečná pro studium strukturních a funkčních charakteristik značeného proteinu v makromolekulárním nebo jednokomolekulárním měřítku pomocí fluorescenční mikroskopie.


Dalším využitím GFP je exprese proteinu v malých sadách specifických buněk. To umožňuje opticky detekovat specifické typy buněk in vitro (ve zkumavce) nebo dokonce in vivo (v živém organismu). Genetické kombinování několika spektrálních variant GFP je užitečným trikem pro analýzu fungování mozku ( Brainbow ). Další zajímavá použití fluorescenčních proteinů v  zahrnuje použití FP jako senzorů potenciálu neuronových membrán, sledování AMPA receptorů na buněčných membránách, vstup viru a infekce chřipkovými viry a lentiviry, (jedná se o jeden ze sedmi rodů čeledi Retroviridae, což jsou lidské a zvířecí patogeny, o nichž je známo, že mají dlouhou inkubační dobu a přetrvávající infekci).


Ukázalo se, že GFP je užitečný v kryobiologii jako test životaschopnosti . 

Korelace životaschopnosti měřená zkouškami trypanovou modří byla 0,97. Další aplikací je použití kotransfekce GFP jako vnitřní kontroly účinnosti transfekce (vnášení DNA do buněk) v savčích buňkách.

Nové možné použití GFP zahrnují jeho použití jako citlivého monitoru intracelulárních procesů prostřednictvím laserového systému eGFP vyrobeného z embryonální lidské buněčné linie ledviny. První vytvořený živý laser byl vyroben buňkou exprimující eGFP uvnitř reflexní optické dutiny při dopadech pulzů modrého světla. Při určité prahové hodnotě pulsu se optický výstup eGFP stává jasnějším a je zcela rovnoměrně zbarven čistě zelenou barvou s vlnovou délkou 516 nm.

GFP se široce používá ve výzkumu rakoviny k označování a sledování rakovinných buněk. Pomocí GFP značené rakovinné buňky byly použity k modelování metastáz, procesu, kterým se rakovinné buňky šíří do vzdálených orgánů.



Myši exprimující GFP pod UV světlem (vlevo a vpravo), ve srovnání s normální myší (uprostřed)



Pomocí GFP byl vytvořen Alba , zeleně fluoreskující králík, ve francouzské laboratoři vedené Eduardem Kacem pro umělecké účely. Americká společnost Yorktown Technologies prodává akvarijním obchodům zelenš fluoreskující rybičky zebrafish ( GloFish ), kmen rybek, který byl původně vyvinut pro detekci znečištění vod. NeonPets, společnost se sídlem v USA, prodala zelené fluorescenční myši jako mazlíčky. Zelená fluorescentní prasata, známá jako Noels, byla vytvořena skupinou vedenou Wu Shinn-Chihem na katedře vědy a technologie zvířat na Tchaj-wanské univerzitě . Japonsko-americký tým vytvořil zeleně fluoreskující kočky, aby je mohl potenciálně použít jako modelové organismy pro nemoci, zejména HIV .



Pin on GENRE - Animals