Kvasinky

VITÁLNÍ BARVENÍ KVASINEK V technologických provozech využívajících kvasinky se používá k odhadu živé a mrtvé populace tzv. vitální barvení. Nejčastěji se barví methylenovou modří ve vhodném pufru (fosfátový pufr pH 4,6), ale lze použít i jiná barviva. Barvivem se obarví jen mrtvé buňky, u kterých se po smrti zvyšuje propustnost cytoplazmatické membrány. Živé buňky zůstanou neobarvené. Barvivo samotné je ale mírně toxické, proto je nutné obarvené buňky ihned pozorovat, jinak se zvýší podíl mrtvých buněk. Potřeby: Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, slabý roztok methylenové modři v pufru, kapátko 

Postup: 1. Na podložní mikroskopické sklíčko naneste malou kapku suspenze kvasinek 

2. Přikápněte malou kapku methylenové modři, nebo neutrální červeně, nebo Lugolova roztoku a přikryjte opatrně mikroskopickým sklíčkem 

3. Pozorujte pod mikroskopem při zvětšení 100x-500x. 

Vyhodnocení: Spočítejte počet obarvených (mrtvých) a neobarvených (živých) buněk nejméně v 10 zorných polích mikroskopu. 

Pro každé zorné pole vypočítejte podíl mrtvých buněk v procentech a ze všech 10 polí pak aritmetický průměr a směrodatnou odchylku (nejlépe na počítači). 

Poznámky: 1. Ve směsi se pravděpodobně budou nacházet kromě kvasinek i bakterie s podstatně menšími buňkami. Bakterie nepočítejte. 

2. Pokud narazíte na pučící kvasinku, počítejte ji jako jednu. 

3. Dvě cca stejně velké byť neoddělené buňky už ale počítejte za dvě. 

4. Pokud buňky tvoří pseudomycelium, počítá se každá dorostlá buňka. 

5. Pro otestování obarvení se doporučuje nejprve obarvit pokusně usmrcenou kulturu kvasinek. Malou kapku kultury na podložním sklíčku protáhněte několikrát opatrně plamenem kahanu, čímž dojde k usmrcení buněk. Pak přikápněte methylenovou modř a pozorujte zabarvení buněk pod mikroskopem. 

Různé barvící techniky jsou při mikroskopování hojně využívané. Jejich smyslem je zdůraznit některé struktury, popř. je odlišit od jiných struktur. Barvení podle Grama je procedura, kterou objevil v roce 1884 tým dánského vědce Hanse Christiana Grama a která umožňuje rozlišit grampozitivní a gramnegativní bakterie. 

V době 16 objevu nebylo známo mnoho o struktuře bakteriální stěny, nicméně Gramovo barvení se začalo používat jako jeden z diagnostických a taxonomických ukazatelů a používá se tak dodnes. 

Principem procedury je barvení usmrcené bakteriální kultury roztokem krystalové violetě a Lugolova roztoku2 a následné odbarvení působením organického rozpouštědla, např. ethanolu nebo acetonu. Grampozitivní bakterie zůstanou filaově obarvené i po působení organického rozpouštědla, zatímco gramnegativní se odbarví. Aby byly i odbarvené gramnegativní bakterie lépe pozorovatelné pod mikroskopem, dobarví se kultura nějakým světlejším barvivem, nejčastěji safraninem na červeno. 

POSTUP Následující postup zopakujte několikrát pro vzorky grampozitivních i gramnegativních bakterií. 

1. Vezměte podložní mikroskopické sklíčko a pomocí kličky na něj rozetřete malé množství bakteriální suspenze narostlé na agarové misce. 

2. Kulturu vysušte nad plamenem a pak fixujte protažením v plameni. 

3. Na fixovaný preparát kápněte kapku krystalové violeti, nechte působit cca 15-20 sekund a přebytečné barvivo slijte 

4. Přikápněte kapku Lugolova roztoku, nechte působit 15-20 sekund a přebytečné barvivo slijte. 

5. Opláchněte barvivo ethanolem a hned poté vodou. Přebytečnou vodu odcákněte. 

6. Kápněte na vzorek roztok safraninu a nechte působit cca 1 minutu. 

7. Opláchněte sklíčko vodou a vysušte nad kahanem. 

8. Kápněte na obarvený preparát malou kapičku imerzního oleje a pozorujte při zvětšení 10x100. 

Poznámky: • Gramovo barvení vyžaduje poměrně přesnou práci a na první pokus se obvykle nepovede. V takovém případě nezoufejte a zkuste to znovu. • Nejčastější problémy bývají způsobené příliš hustou kulturou bakterií, příliš dlouhou fixací v plameni a příliš dlouhým odbarvováním ethanolem.

https://web2.mendelu.cz/af_291_projekty/files/23/23-potravinarska_mikrobiologie__navody_do_cviceni-pmzii.pdf

Jogurt

https://is.muni.cz/el/1431/jaro2016/C4221/um/Uloha7_Mikroskopovani.pdf