Rybník

Co se hýbe v rybníku? 

Chytíme a zkusíme obarvit

Pokud ze cvičení bude protokol, vytvořte tabulku

Vitální barviva

methylenová modř - odliší živé buňky od mrtvých. Živé se neobarví. Můžeme zkusit pozorovat živé a pak protáhnout sklíčko plamenem.

Janusova zeleň barví mitochondrie (supravitální barvení),  eosin

Supravitální barvení znamená barvení mokrého nefixovaného preparátu, ve kterém některé buněčné elementy dosud dožívají - proto supravitální. 

Zkusíme i Giemsovo barvivo a acetokarmín jako vitální a pro jistotu i Hematoxylin - barví jádra, ten asi ale vitálně barvit nebude.

Fixujeme etanolem

Giemsovo barvivo je roztok metylénové modři, azuru a eosinu v metanolu a glycerolu. Barvení mikroskopických preparátů podle Giemsy je založeno na absorpci tohoto roztoku organickými strukturami.

Používá se nejčastěji k obarvení krevního nátěru nebo fixovaného vaginálního stěru. Znázorňují se prvoci, chlamydie, bakterie, mykoplazmata, virové inkluze, organely a buněčné struktury.

Postup

Kápneme metanol (etanol), pak Giemsův roztok

Giemsův roztok se používá buď koncentrovaný, nebo ředěný destilovanou vodou. Fixovaný preparát se namáčí standardně na 30 minut, v naléhavých případech je možné zvýšit koncentraci a dobu barvení zkrátit.

Bakterie se barví modře, pouzdra světle modře, sliz růžově.

Fixujeme etanolem

Barvení zředěným roztokem MAY-GRÜNWALDOVÝM

zředění 1:1 destilovanou vodou

barví se 1 min

slijeme, neoplachujeme

Barvení roztokem GIEMSA-ROMANOWSKI 

eosin, methylenová modř, azur A, methylenová violeť

asi 15 min

Opláchnutí destilovanou vodou

Usušení

vertikální poloha, nekryje se krycím sklíčkem – to je ale pro krevní roztěr, my to raději přikryjeme.

Hematoxylin barví jádra

nebarví komponenty tkáně přímo. Barví až oxidovaný na hematein a teprve pak tvoří s různými kationty barevné laky. Proto také existuje celá řada hematoxylinů. Hematoxylin je specifické barvivo pro jednu tkáňovou složku - jádro, které barví modře.

Řezy tkáně na podložních sklíčkách jsou připraveny k barvení, které sestává z těchto kroků:

deparafinace;

zavodnění;

vlastní barvení;

odvodnění;

projasnění;

zamontování;

Tak asi nám to nebude fungovat jen po fixaci etanolem, nicméně zkusíme to.

Acetokarmín fixace

Na podložní sklíčko do kapky vody přikápneme acetokarmín, opatrně nahřejeme nad kahanem (barvivo se nesmí srážet), necháme 2 min. stát 

a přikryjeme krycím sklíčkem, pozorujeme pod mikroskopem

Acetokarmín Karmín se používá v biologii k přípravě preparátů pro mikroskopii, barví červeně mimo jiné jádra a glykogen. Roztok karmínu v kyselině octové je acetokarmín

Karmín (též karmazín nebo košenila) je přírodní červené barvivo vyráběné z vysušených těl hmyzu červce nopálového (Dactylopius coccus). Původem pochází z amerického kontinentu, odkud pochází rostliny druhu opuncie, na kterých hmyz rodu Dactylopius žije a jejichž samička obsahuje tohoto barviva přibližně 10 % sušiny. Po usušení se červci uvaří a barvivo se vysráží síranem hlinitoamonným. Jako barvivo se používá např. v potravinách a kosmetice. Vzhledem k poměrně vysoké ceně je často nahrazováno jinými barvivy.

Nejzákladnější a nejčastěji používanou metodou je barvení hematoxylinem a eozinem, kde se kombinují dvě barviva – hematoxylin (barví modře) a syntetické kyselé barvivo eosin.[4] Jiným kombinovaným barvením je Weigertův železitý hematoxylin-van Gieson. Železitý hematoxylin se používá k barvení jader, následně se dobarvuje kyselým fuchsinem a kyselinou pikrovou. Hematoxylin zbarví jádra temně hnědě, fuchsin zbarví kolagenní vlákna červeně a kyselina svaly žlutě. Modrý Massonův trichom je kombinace železitého hematoxylinu, kyselého fuchsinu a anilinové modři.

 Toto barvení vyžaduje zvláště tenké řezy. Výsledkem jsou černá jádra, červená cytoplasma většiny buněk a modrá kolagenní vlákna.[1] Žlutý Massonův trichom je tvořen třemi barvivy: kamencový nebo Weigertův železitý hematoxylin, erytrozin a šafrán.

 Výsledkem jsou modře nebo černě zbarvená jádra (podle užitého hematoxylinu), červená cytoplazma buněk a zlatožlutý kolagen. Málo užívaným barvivem na barvení elastiky je Verhoeffův jódový hematoxylin, který barví elastická vlákna a jádra černě.

Barvení – Janusova zeleň (supravitální barvení), eosin

Supravitální barvení znamená barvení mokrého nefixovaného preparátu, ve kterém některé buněčné elementy dosud dožívají - proto supravitální. Barvicí roztok dle Sternheimera, jak již bylo zmíněno, se skládá ze dvou zcela odlišných barviv : Velikost: 0.5-1

μm x 3-5μm

Barvivo sudanová čerň není rozpustné ve vodě, ale je dobře rozpustné v alkoholovém a lipidovém médiu. Této vlastnosti se využívá k cytochemickému stanovení lipidů v krevních nátěrech periferní krve a kostní dřeně a k histochemickému stanovení lipidů v tkáňových řezech.

V prostředí fosfátového pufru a za přítomnosti alkoholu se sudanofilní depozita barví tmavě - modře, zatímco cytoplazma buněk zůstává bezbarvá.

Oranž II

Louh jako fixace, nebo fixace etanolem a bez louhu

Akridinová oranž

Složky

prášková akridinová oranž, destilovaná voda

Příprava

Používá se 1% vodný roztok. Do 10 ml vody přidáme 0,1 g akridinové oranže.

Skladování

Uchováváme v tmavé lahvičce.

Poznámky

Používá se pro fluorescenční mikroskopii. Akridin je mutagenní látka, opatrně při práci. "Více"http://www.merck-chemicals.com/czech-republic/akridinova-oran%C5%BE-chlorid-zine%C4%8Dnat%C3%BD-podvojna-s%C5%AFl-c-i-46005/MDA_CHEM-115931/p_vu.b.s1LZb8AAAEWZuEfVhTl Sehnat ji můžeme např "tady"https://www.mecomm.cz/